多年的临床实践使李时珍懂得，做一名医生，不仅要懂医理也要懂药理。如果把药物的形态和性能搞错了，就会闹出人命。他在阅读《神农本草经》的基础上，再仔细地阅读了南朝齐梁时期陶弘景著的《本草经集注》、唐代的《新修本草》、宋代的《开宝本草》《经史证类备急本草》《本草衍义》等。在阅读中发现了前人本草著作中的诸多错误，于是立志重新编撰一部本草著作。为写成这部书，他穷毕生精力亲历实践，广收博采，历时30年，几易其稿，终于完成《本草纲目》。
《本草纲目》成书后四百多年来成为医家、读书人必修之圣典，成为普通百姓活命养生的医药宝库。现代著名史学家、文学家郭沫若高度评价了李时珍在医学史上的丰功伟绩：“医中之圣，集中国药学之大成，《本草纲目》乃1892种药物说明，广罗博采，曾费三十年之殚精。造福生民，使多少人延年活命！伟哉夫子，将随民族生命永生。”
《本草纲目》共有52卷，载有药物1892种，其中载有新药374种，收集药方11096个，书中还绘制了1160幅精美的插图，约190万字，分为16部、60类。书中对药物的分类改变了此前本草学著作中上、中、下三品分类法，采取了“析族区类，振纲分目”的科学分类。它把药物分矿物药、植物药、动物药。又将矿物药分为金部、玉部、石部、卤部四部。植物药一类，根据植物的性能、形态及其生长的环境，区别为草部、谷部、菜部、果部、木部五部；草部又分为山草、芳草、毒草、水草、蔓草、石草等小类。动物一类，按低级向高级进化的顺序排列为虫部、鳞部、介部、禽部、兽部、人部六部。这种分类法，已经过渡到按自然演化的系统来进行。从无机到有机，从简单到复杂，从低级到高级，这种分类法明显含有生物进化的思想，受到达尔文的高度重视。每种药物分列释名（确定名称）、集解（叙述产地）、正误（更正过去文献的错误）、修治（炮制方法）、气味、主治、发明（前三项指分析药物的功能）、附方（收集民间流传的药方）等项。